從技術(shù)的角度看，隨著單細胞測序技術(shù)的發(fā)展，其研究范圍不再局限于轉(zhuǎn)錄組，而是擴展到了基因組、免疫組、表觀組、蛋白組等多組學水平，研究對象涉及染色質(zhì)、DNA、表觀、轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白、細胞表面蛋白等多種分子信息。基于單細胞多組學數(shù)據(jù)，細胞聚類既可以通過來自相似細胞群的參考數(shù)據(jù)集中現(xiàn)有的細胞類型注釋對細胞進行聚類，也可以執(zhí)行無監(jiān)督聚類來識別相似細胞組，并利用其它分子層面數(shù)據(jù)來進行的更精細的劃分。
例如轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可用于鑒定不同細胞類型或狀態(tài)之間差異表達的基因，基因組數(shù)據(jù)能夠在單細胞水平檢測基因拷貝數(shù)變化、單堿基突變、插入缺失及等信息，染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)可用于鑒定可及區(qū)域和富集的 DNA 基序，表觀組數(shù)據(jù)可用于鑒定不同細胞類型或狀態(tài)之間的差異甲基化區(qū)域，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)可用于了解細胞間相互作用等。此外，近年來新出現(xiàn)的空間轉(zhuǎn)錄組測序方法及其數(shù)據(jù)整合算法，提供了細胞的空間信息，為單細胞測序技術(shù)進行了補充。
而從應用角度看，在腫瘤發(fā)生等復雜的生物過程中，異質(zhì)性同時存在于基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組、免疫組等多層面，基因相同的腫瘤細胞可能具有不同的 DNA 甲基化、基因表達、克隆擴增模式，因此常常需要多組學技術(shù)才能更加準確地將它們分類為不同亞群，揭示更深層的生物學機制。
圖 4-5 多組學數(shù)據(jù)整合下的細胞聚類與注釋
(Tim et al. Nature reviews genetics 2018)
圖 4-6 單細胞測序技術(shù)擴展到多組學和多分子水平
單細胞免疫組測序
免疫組庫是指在特定時間段內(nèi)，機體所有有功能的 T 細胞和 B 細胞的總和。人體的適應性免疫系統(tǒng)主要依靠于 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞表面的 T 細胞受體（TCR) 和 B 細胞受體（BCR)，其受體上的互補決定區(qū)（CDR) 與 MHC- 抗原肽分子進行識別并特異性結(jié)合。BCR/TCR 存在一塊區(qū)域叫作互補決定區(qū)（CDR), 由 CDR1、CDR2、CDR3 組成，CDR1 和 CDR2 都是由 V 基因編碼，而 CDR3 是由 V、D、J 三個基因編碼形成，所以 CDR3 多樣性程度高，是主要參與抗原識別的區(qū)域。
免疫組庫測序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)) 是以 T/B 淋巴細胞為研究目標，通過多重 PCR 或 5’RACE 技術(shù)特異性擴增決定 B 淋巴細胞受體（BCR) 或 T 淋巴細胞受體（TCR) 多樣性的互補決定區(qū)（CDR3 區(qū)），再結(jié)合高通量測序技術(shù)，全面評估免疫系統(tǒng)的多樣性，深入挖掘免疫組庫與疾病的關(guān)系。免疫組庫測序技術(shù)應用非常廣泛，目前已經(jīng)在腫瘤預后評價、白血病微小殘留病變監(jiān)測、自身免疫性疾病診斷和疾病生物標志物開發(fā)等方面取得了一定的進展。
單細胞免疫組庫測序是在免疫組庫測序加入單細胞分選技術(shù)，在單細胞水平進行的免疫組庫測序，可在免疫組庫測序提供的信息基礎上，揭示細胞的免疫異質(zhì)性信息，更加全面、深入地揭示腫瘤、疾病中的免疫機制。
單細胞蛋白質(zhì)組學
盡管單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組能夠揭示單細胞水平的 DNA 和 RNA 結(jié)構(gòu)，但是在細胞內(nèi)主要發(fā)揮功能的成分是蛋白質(zhì)，因而研究單細胞蛋白質(zhì)組學成為新興領(lǐng)域。單個細胞中蛋白質(zhì)的總量通常小于 1ng，比用于常規(guī)蛋白質(zhì)組分析的量至少減少 100 倍，而且數(shù)以千計的蛋白質(zhì)具有高度的動態(tài)范圍和化學計量，因而單細胞蛋白質(zhì)組學目前還存在諸多難點，技術(shù)仍處于早期發(fā)展階段。前文介紹的質(zhì)譜流式技術(shù)和其他流式技術(shù)都是目前已有的重要的單細胞蛋白組學技術(shù)。
目前，單細胞蛋白組學技術(shù)主要對細胞表面蛋白的檢測，通過類似于流式細胞術(shù)的表面抗體標記技術(shù)，將細胞的免疫表型與轉(zhuǎn)錄組學得到的細胞群相匹配。不同于流式細胞術(shù)的熒光標記抗體，單細胞表型的蛋白質(zhì)組學使用寡核苷酸耦合的抗體，從而不受限于熒光通道和熒光補償，可以在單細胞表面標記上百種甚至上千種蛋白，從而顯著提高了基于流式細胞術(shù)和質(zhì)譜流式的單細胞蛋白質(zhì)組的通量。
主流的單細胞蛋白質(zhì)組的檢測有 BD 公司的 AbSeq 和 Biolgend 公司的 TotalSeq。
BD 公司的 AbSeq 平臺，結(jié)合 BD 公司的 Rhapsody，將單細胞表面標記和測序相結(jié)合，基于細胞表面的標記的 Hashtag 抗體，能夠?qū)Σ煌瑯悠穪碓吹募毎M行 barcode 標記，提高通量、降低成本。此外如 4.2 章所述，有自身對應的轉(zhuǎn)錄組和免疫組的后續(xù)流程。同為 Rhapsody 系統(tǒng)，使用的蜂巢板技術(shù)是依靠細胞重力自由沉降，避免了 10x Genomics 中存在的碰撞，所以對于起始細胞活性要求較低。此外，BDTMAbSeq 抗體 - 寡核苷酸復合物利用寡核苷酸測序來獲得多重蛋白檢測，用于單細胞水平的多組學分析，使得研究者可以在同一實驗中同時檢測蛋白質(zhì)（抗體 - 抗原相互作用分析）和 mRNA 表達。BD 多樣本分析試劑盒，同樣利用抗體偶聯(lián)樣本標簽（寡核苷酸序列）對不同來源樣本進行標記，然后混樣進行檢測，可以顯著降低時間成本和實驗成本（較多可實現(xiàn) 12 個樣本的同時檢測），還可以通過樣本標簽識別多細胞數(shù)據(jù)，提高單細胞數(shù)據(jù)質(zhì)量。
Biolgend 的 TotalSeq 技術(shù)是目前應用較廣泛的單細胞蛋白質(zhì)組方案。TotalSeq 無縫對接現(xiàn)有的單細胞 RNA 測序工作流程中，包括 Drop-Seq 和 10x Genomics 提供的工作流程，如 Cellranger 等，使數(shù)據(jù)分析效率顯著提高。同時提供三類不同的寡核苷酸偶聯(lián)抗體：TotalSeqA, B, C，分別對應 10x Genomics 的單細胞轉(zhuǎn)錄組和免疫組的應用。現(xiàn)有的表面標記抗體超過一千種，能夠?qū)渭毎拿庖弑硇瓦M行全面解讀。同時開發(fā) cell-hashing 的技術(shù)，使用 hashtag 抗體對不同樣本進行標記，從而在后續(xù)分析中通過去卷積的方法獲得對應樣品的數(shù)據(jù)信息，顯著提高輸入樣品的通量和實驗成本。此外，Biolegend 提供預制混合好的凍干的抗體組合，使用方便且通量提高。
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